Agaroosigeelielektroforeesi

Tässä nyt ei tule muuta mieleen kuin se, että EtBr ei ole tasaisesti agaroosin seassa... Oletko varmasti sekoittanut geelin hyvin ennen kaatamista?

Tarkista, että käytät EtBr:a oikean määrän (0,5 µg/ml), voit myös kokeilla värjätä geelin jälkeenpäin.

Mitään muuta tässä ei tule mieleen, jos olet kokeillut laittaa näytteet eri päin geelille, niin niistäkään se ei voi johtua.

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Agarose_Gel_Electrophor.jpg

Jos tarkoitat tämän tyyppistä lopputulosta (geelin yläosa kirkkaampi kuin alaosa), niin syy on tässä:

Bändien intensiteettien erot aiheutuvat siitä että Et-Br liikkuu geelillä ajon aikana. Siis kun DNA liikkuu kohti " napaa", niin Et-Br liikkuu kohti "- napaa". Tästä syystä, omasta mielestäni, DNA pitoisuuden arvioiminen (ts. arpominen) geelikuvasta on yleensä täysin mahdotonta ja harhaanjohtavaa analysointia.

Voin olla tässä väärässä, mutta luulen ettei Et-Br haihdu kovinkaan helposti. Molekyylimassa lähes 400 ja puhtaan aineen sulamispiste 260 'C. Joku kemisti voisi antaa tähän valistuneemman arvion. :p Itsekkin kyllä lisään sen vasta agaroosin sulatuksen jälkeen, mutta vain siitä syystä että pelkän agaroosin siivoaminen on turvallisempaa kuin potentiaalisen myrkyn.

http://en.wikipedia.org/wiki/Ethidium_bromide

Helpoin ratkaisu ongelmaasi: käytä kahta geeliä, joissa 8 kuoppaa molemmissa ja aja geelit vain "puoleen väliin" asti.

EtBr on huono merkintä etidiumbromidille, koska se tarkoittaa kemiassa yleisesti etyylibromidia. Etyylibromidi varmastikin haihtuisi, koska kiehumispiste on 38 celsiusta, mutta etidiumbromidi ei taatusti haihdu, koska se vasta sulaa 260 celsiuksessa.

Taitaa olla niin, että vahvempien bändien myös kuuluu näkyä geelillä voimakkaammin...Että ihan oikealta kuulostaa.