Nyt olisi pieni pulma ratkottavana molekyylibiologian tutkijoille ja laboranteille.
Teen agaroosigeelielektroforeesin 3 %:lla agaroosigeelillä (3 g agaroosia, 100 ml 1X TBE) johon lisään 60 mikrolitraa etidiumbromidia. Etidiumbromidin lisään vasta, kun liuos on sen verran jäähtynyt, että voin pidellä pulloa kädessäni. Muutenhan EtBr haihtuisi, eikö niin?
Minulle tulee jostain syystä sellaista tulosta, että jommassa kummassa päässä geeliä bändit ovat haaleita. Toisessa päässä geeliä bändit loistavat kuin aurinko (joka on tietysti hyvä asia).Tämä ei voi johtua näytteistä enää, koska olen tehnyt homman jo sen verran monta kertaa.
Geelissäni on kaikkiaan 16 kuoppaa (8 kuoppaa per rivi).
Mitä kannattaisi kokeilla?
Agaroosigeelielektroforeesi
kysyväinen
5
2011
Vastaukset
- Nanna*
Tässä nyt ei tule muuta mieleen kuin se, että EtBr ei ole tasaisesti agaroosin seassa... Oletko varmasti sekoittanut geelin hyvin ennen kaatamista?
Tarkista, että käytät EtBr:a oikean määrän (0,5 µg/ml), voit myös kokeilla värjätä geelin jälkeenpäin.
Mitään muuta tässä ei tule mieleen, jos olet kokeillut laittaa näytteet eri päin geelille, niin niistäkään se ei voi johtua. - molekyylibiologi
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Agarose_Gel_Electrophor.jpg
Jos tarkoitat tämän tyyppistä lopputulosta (geelin yläosa kirkkaampi kuin alaosa), niin syy on tässä:
Bändien intensiteettien erot aiheutuvat siitä että Et-Br liikkuu geelillä ajon aikana. Siis kun DNA liikkuu kohti " napaa", niin Et-Br liikkuu kohti "- napaa". Tästä syystä, omasta mielestäni, DNA pitoisuuden arvioiminen (ts. arpominen) geelikuvasta on yleensä täysin mahdotonta ja harhaanjohtavaa analysointia.
Voin olla tässä väärässä, mutta luulen ettei Et-Br haihdu kovinkaan helposti. Molekyylimassa lähes 400 ja puhtaan aineen sulamispiste 260 'C. Joku kemisti voisi antaa tähän valistuneemman arvion. :p Itsekkin kyllä lisään sen vasta agaroosin sulatuksen jälkeen, mutta vain siitä syystä että pelkän agaroosin siivoaminen on turvallisempaa kuin potentiaalisen myrkyn.
http://en.wikipedia.org/wiki/Ethidium_bromide
Helpoin ratkaisu ongelmaasi: käytä kahta geeliä, joissa 8 kuoppaa molemmissa ja aja geelit vain "puoleen väliin" asti. - kemisti
EtBr on huono merkintä etidiumbromidille, koska se tarkoittaa kemiassa yleisesti etyylibromidia. Etyylibromidi varmastikin haihtuisi, koska kiehumispiste on 38 celsiusta, mutta etidiumbromidi ei taatusti haihdu, koska se vasta sulaa 260 celsiuksessa.
- Biokemisti
Taitaa olla niin, että vahvempien bändien myös kuuluu näkyä geelillä voimakkaammin...Että ihan oikealta kuulostaa.
- joku "osaamaton"
"Tarkista, että käytät EtBr:a oikean määrän (0,5 µg/ml), voit myös kokeilla värjätä geelin jälkeenpäin." tosiaan tarkista aluksi tuo lasku, että suhde on oikea. Koska 60 ml:n 1%:seen liuokseen menee EtBr:a 3 µl:a niin epäilen tuota sinun 60 µl:a.
-Sekoita aluksi agaroosi TBEhen ja lämmitä, vaikka mikroaaltouunissa (niin kauan että se on täysin homogeeninen). Lisää EtBr kuhan liuos on suurin piirtein 65 celcius asteista.
-Anna geelin jähmettyä, poista kampa.
-Pipetoi näytteet kaivoihin, standardia yleensä 10 µl, näytteitä 20 µl.
-Tarkista geelin ajosuunta, ajo kohti positiivista napaa. joten kaivot on sillon negatiivisessa päässä.
Ajo kestää 30 minuutista alle kahteen tuntiin, 45 minuutin kohdalla on hyvä ruveta jo tarkkailemaan..
Ketjusta on poistettu 0 sääntöjenvastaista viestiä.
Luetuimmat keskustelut
Lindtman I vasemmistohallitus aloittaa viimein Suomen kuntoon laittamisen
Tässä nyt on 3 vuotta seurattu irvokasta kärsimysnäytelmää nimeltään "valtion budjetin tasapainotus by äärioikeisto", ja1892704Missä viipyy persujen lupaama euron bensa?
En edes muista milloin bensapumpussa olisi ollut ykkösellä alkava litrahinta. Missä siis viipyy persujen lupaama euron b1482407Kirje, PellePelottomalle.
Tärkeää olisi luoda ystävyys, että se, jota rakastaa, on samalla paras ystävä ja luotettavin, jolle voi ja uskaltaa luot1061132- 94989
- 64921
Martinan hevoset.
Tämä todella kaunis ja ketterä harmaa hevonen jolla monet kilpailut voitetaan ei ole Martinan.Tytär ratsastaa sillä tait241826Mistä löytyy naisseuraa sinkkumiehelle?
Kertokaapas kokeneemmat mistä löytyis naisseuraa sinkulle. Ihan ois eukko nyt tosissaan hakusessa. Tanssipaikat kun on a20820Persut jakavat tekoälyllä tehtyjä kuvia maahanmuuttajista somessa
Eivät mainitse, että ovat tekoälyllä tehtyjä. Eivät näe asiassa mitään ongelmaa. Valehtelijapuolue taas vauhdissa. Unka288791Voi teitä naisia
Suudeltiin ja nukuttiin toisissamme kiinni mutta pillua ei tullu, ei edes aamulla. t.38vmies90785Hyvä meininki
TTP:ssa väkeä tosi runsaasti paikalla. Hyvää ruokaa jälleen ja munkit ja sima erinomaista. Kiitos yrittäjälle! Hieno Vap22718